NOTAS DE INTERES
Qué es el ELISA
y Cómo Funciona.

Guilermo Guirin. Laboratorio de Microbiología. Universidad Nacional de Lanús. laboratorio@unla.edu.ar

La enfermedad celíaca es un trastorno inmunológico (enfermedad autoinmune) producida por un proteína llamada gluten. Las personas que la padecen, al ingerir esta proteína, les genera una reacción inmunológica exacervada contra el intestino produciendo desde problemas gastroentéricos (imposibilidad de absorción de hierro y calcio, entre otras) hasta cuadros de desnutrición severos.
Es por ello que la dieta debe ser libre de TACC (trigo, avena, cebada y centeno). La mayoría de los productos farináceos se elaboran con este tipo de harinas, por lo tanto el consumo de productos para celíacos debe ser controlado por un laboratorio certificado. El gluten está compuesto por dos proteínas: gliadina  y glutenina. Esta última es la que produce el efecto sobre los pacientes.
Tanto en la Argentina como en el resto del mundo no existe un marco regulatorio consolidado para la detección de gluten. Sin embargo, la técnica más utilizada es el ELISA. En el mercado existe una empresa alemana R-Biopharm que elabora estos Kits.
Que es un ELISA? Es un ensayo inmunoenzimático. Esto quiere decir que es un método que posee una alta especificidad y alta sensibilidad, de esta manera uno pude estar seguro de los resultados obtenidos. Ya sean positivos o negativos.
Si bien como se mencionó anteriormente, la glutenina es la proteína que produce la reacción autoinmune tiene una relación directa y proporcional a la gliadina. Es por ello que los kits se diseñan para gliadina.

¿Qué es un Kit de ELISA para la
detección de gliadina?
Primero se debe sensibilizar (pegar) con anticuerpos monoclonales (obtenidos de hibridomas) antigliadina en unos micropocillos (foto). Aquí se colocará la muestra a analizar previamente tratada. Tratamiento de la muestra: se debe pesar 1 gr. de muestra y agregarle 10 ml de alcohol 60 %. El gluten se disolverá en este, se mezcla en un agitador durante 30 minutos y luego se centrifuga para bajar todas las partículas alimenticias. Por lo tanto queda en el sobrenadante (parte liquida y superior de tubo) la gliadina disuelta en alcohol. Se toma una pequeña fracción y se siembra en los micropocillos. Conjuntamente, para poder determinar la cantidad de gliadina presente se debe calibrar una curva. Para ello el kit trae seis estándares de concentraciones conocidas de gliadina (0, 5, 10, 20, 40 y 80 ppb). Cada uno de ellos también se siembran en los micropocillos. Una vez realizado esto se lo deja reposar durante 30 minutos.

En esta etapa, si hay gliadina presente en las muestras, se pegará a los anticuerpos que están adheridos en los micropocillos. Luego se lava con un buffer varias veces para eliminar los restos. Paso seguido se siembra otro anticuerpo (el cual posee una enzima adosada) que se pegará a la gliadina ya adherida (30 minutos), de aquí el nombre ELISA sandwich. Se vuelve a lavar y por último se agrega un sustrato para que funcione la enzima y un cromógeno (30 minutos). Si efectivamente las muestras analizadas tienen gliadina las enzimas adheridas al segundo anticuerpo producirán una reacción que conjuntamente con el cromógeno dará un cambio de color. Este cambio de color es proporcional a la cantidad de gliadina.

Para una correcta lectura de los datos los micropocillos se deben colocar en un equipo (lector de ELISA) el cual mide la absorbancia de la luz transmitida y de esta manera se obtienen los resultados. Luego a través de un software específico se realizan los cálculos para la cuantificación de gliadina. La especificidad y sensibilidad del método es superior al 99 %. El limite de detección es de 5 ppm (partes por millón, o sea 5 mg de gliadina/Kg de alimento). Para nosotros aquellos alimentos que poseen un valor de 5 ppm o superior no lo consideramos apto para celíacos.
Si bien esta metodología no es complicada el personal que la realiza debe estar muy bien capacitado.

Algunos aspectos a tener en cuenta
a la hora de realizar los análisis.

El gluten no se destruye con el calor y es altamente contaminante y volátil (las personas lo podemos transportar en la piel, ropa y utensilios). Por ello siempre debe usarse material descartable (tubos, tips, etc). Medidas de seguridad: además de lo mencionado es conveniente trabajar en cabinas de bioseguridad ya que estos equipos filtran el aire. Particularmente en nuestro laboratorio tenemos micropipetas que sólo se utilizan para realizar estos análisis. Tanto los operarios como todas las superficies de trabajo deben limpiarse con alcohol 70 % para eliminar toda posibilidad de contaminación externa.

Estos detalles son muy importantes ya que sino se realizan estas medidas de control las muestras pueden contaminarse y dar falsos positivos presentando perjuicios para los productores y consumidores.